InsightRP2
Neue Forschungswege beschreiten
moderne Therapien entwickeln
Das InsightRP2-Konsortium steht für einen neuartigen, hoch innovativen Forschungsansatz, der komplementäres Fachwissen nutzt, um die vielschichtigen pathophysiologischen Aspekte der RP2-assoziierten Retinitis Pigmentosa zu verstehen und neue Therapieoptionen zu entwickeln.
Besonders ist, dass das Konsortium nicht aus einer Reihe paralleler Forschungslinien besteht, sondern als eng vernetztes Rahmenwerk agiert, das die einzelnen Forschungsbereiche aktiv und systematisch miteinander verknüpft. Hierzu bringen wir hoch motivierte Expert*innen aus den Bereichen Augenheilkunde, Humangenetik, Datenwissenschaft, Zellbiologie und Gentherapie zusammen. InsightRP2 ermöglicht es, klinische Beobachtungen in mechanistische Studien einfließen zu lassen, bioinformatische Ansätze zur Interpretation von Varianten und zur Gestaltung von Experimenten zu nutzen und (patho)physiologische Erkenntnisse in therapeutische Strategien umzusetzen.
Digitale Ophthalmologie
Digitale Ophthalmologie
Mit eigens entwickelten KI-Algorithmen analysieren wir retinale Bilddaten wie Fundusaufnahmen und OCTs von Patient*innen mit RP2-assoziierter RP, um hierüber selbst feine strukturelle Veränderungen der Netzhaut zu erfassen und zu entschlüsseln. So wollen wir den Krankheitsverlauf anhand objektiver morphologischer Kriterien beschreiben und klinische Diagnostik, Verlaufsbeurteilung und Therapiebewertung verbessern.
Detail-Beschreibung
Die RP2‑assoziierte Retinitis pigmentosa ist durch einen progredienten Verlust von Fotorezeptoren und eine ausgeprägte strukturelle Umgestaltung der Netzhaut gekennzeichnet. Diese Veränderungen stellen sich als charakteristische Biomarker dar, die sich durch verschiedene Bildgebungsverfahren erfassen lassen: In der Farbfundusfotografie zeigen sich verengte Netzhautgefäße sowie die Anreicherung von Pigmentklümpchen an der Netzhautoberfläche. Die optische Kohärenztomografie (OCT) liefert Querschnittsaufnahmen, mit denen sich Veränderungen der Netzhautschichten (z. B. Ausdünnung der Außensegmente), Störungen der Mikrostrukturen infolge des Fotorezeptorverlusts, Veränderungen der Makula sowie mikrovaskuläre Läsionen darstellen lassen. Die Fundusautofluoreszenz erlaubt zusätzlich die Detektion gestörter Stoffwechselaktivität im Netzhautgewebe, sichtbar als hyper‑ oder hypoautofluoreszente Areale.
Um diese komplexen visuellen Informationen in aussagekräftige und quantifizierbare Daten zu überführen, entwickeln und trainieren wir spezialisierte Modelle für jede Bildgebungsmodalität. Auf diese Weise identifizieren wir wesentliche Indikatoren für bestimmte Krankheitsstadien – von bekannten klinischen Markern bis hin zu subtilen Mustern, die nur in der computergestützten Analyse erkennbar sind. Die Informationen aus den unterschiedlichen Bilddaten werden dann in einer gemeinsamen, hochdimensionalen digitalen Karte zusammengeführt. Dieser integrierte Datensatz bildet die Grundlage für hochpräzise retinale Segmentierung, eine objektive Stadieneinteilung der Erkrankung sowie Modelle zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs. Langfristig wollen wir so einen digitalen Morphologie‑Atlas zum natürlichen Verlauf der RP2‑assoziierten Retinitis pigmentosa erstellen.
Durch die Kombination der digitalen morphologischen Profile mit genetischen und klinischen Daten möchten wir interindividuelle Unterschiede im Krankheitsverlauf besser charakterisieren und potenzielle Genotyp‑Phänotyp‑Korrelationen untersuchen. Perspektivisch soll der RP2‑spezifische digitale Morphologie‑Atlas zur Entwicklung standardisierter Einschlusskriterien und klinisch relevanter Endpunkte für zukünftige therapeutische Studien beitragen.
Funktionskartierung von Genvarianten
Funktionskartierung von Genvarianten
Mittels digitaler Hochdurchsatz-Technologien und experimenteller Funktionsassays erfassen wir systematisch alle theoretisch möglichen Varianten des RP2-Gens und untersuchen ihre funktionellen Auswirkungen. So können Varianten unklarer Signifikanz differenzierter bewertet und für die molekulare Interpretation nutzbar gemacht werden.
Detail-Beschreibung
Mehr als die Hälfte der in ClinVar eingetragenen Missense-Varianten im RP2-Gen sind derzeit als „Variant of Uncertain Significance“ (VUS) klassifiziert. Fehlende funktionelle Evidenz erschwert die molekulargenetische Diagnosestellung bei zahlreichen Patient*innen mit Verdacht auf eine RP2-assoziierte Retinitis pigmentosa erheblich und limitiert zugleich die Identifikation geeigneter Individuen für zukünftige klinische Studien. Vor diesem Hintergrund verfolgen wir einen integrativen Ansatz zur systematischen Priorisierung und funktionellen Charakterisierung von RP2-Missense-Varianten.
Hierzu werden verschiedene komplementäre In-silico-Verfahren kombiniert, die unterschiedliche Aspekte möglicher Varianteneffekte erfassen. Strukturbiologische Veränderungen werden mittels AlphaFold-basierter Proteinmodellierung untersucht, um potenzielle Auswirkungen auf Proteinfaltung, Stabilität und funktionelle Domänen des RP2-Proteins zu analysieren. Ergänzend kommen evolutionsbasierte Modelle wie EVE/PoPEVE zum Einsatz, welche die funktionelle Relevanz einzelner Aminosäureaustausche auf Grundlage statistischer Proteinsequenzmodelle und populationsgenetischer Daten bewerten. AlphaMissense wird verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer pathogenen Wirkung von Missense-Varianten mithilfe eines auf umfangreichen Proteinsequenzdaten trainierten Protein Language Models vorherzusagen. Zusätzlich wird mithilfe von SpliceAI untersucht, ob vermeintliche Missense-Varianten gleichzeitig potenzielle Effekte auf das prä-mRNA-Spleißen haben. Die Ergebnisse dieser Analysen werden in einem kombinierten Priorisierungsscore integriert, der strukturelle, evolutionäre sowie splicingrelevante Parameter berücksichtigt. Varianten mit hoher Priorität werden anschließend experimentell in zellulären Modellen untersucht. Hierzu werden verschiedene funktionelle Assays eingesetzt, darunter Analysen der Proteinexpression und -stabilität, Untersuchungen der subzellulären Lokalisation sowie Assays zur Charakterisierung von Aktivität und Interaktionen des RP2-Proteins mit bekannten Bindungspartnern.
Im Sinne eines Plattformansatzes sollen sämtliche biologisch möglichen RP2-Missense-Varianten systematisch untersucht und in einem umfassenden funktionellen Datensatz zusammengeführt werden. Dieser Datensatz soll als Ressource für die präzisere Bewertung von RP2-Varianten für die molekulargenetische Diagnostik RP2-assoziierter Erkrankungen zur Verfügung gestellt werden. Langfristig soll dieser Ansatz dazu beitragen, die diagnostische Aufklärungsrate bei Patienten mit V.a. RP2-assoziierte Retinitis pigmentosa zu verbessern und damit einem größeren Anteil von Patient*innen eine eindeutige molekulargenetische Diagnosestellung sowie den Zugang zu einer gezielten klinischen Versorgung zu ermöglichen.
Mechanistische Einblicke
Mechanistische Einblicke
Um die Rolle von RP2 näher zu charakterisieren, erzeugen wir patientenrelevante Mutationen in induzierten pluripotenten Stammzellen und differenzieren daraus retinale Gewebe und Organoide. Mittels HighEnd Multi-Omics-Technologien und integrativen Datenanalysen untersuchen wir zelltypspezifische Veränderungen und identifizieren potenzielle therapeutische Angriffspunkte.
Detail-Beschreibung
iPSC-basierte Krankheitsmodellierung von RP2
Ein zentraler Ansatz des InsightRP2-Projekts ist der Aufbau humaner, patientennaher iPSC-Modelle, um krankheitsrelevante RP2-Varianten kontrolliert und mechanistisch untersuchen zu können. Hierfür werden induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sowohl aus Patientenzellen generiert als auch mittels CRISPR/Cas9-basierter Genomeditierung gezielt verändert. Auf diese Weise können definierte RP2-Varianten präzise in einen gesunden genetischen Hintergrund eingebracht oder in Patientenzellen korrigiert werden. Solche isogenen Zellpaare sind besonders wertvoll, da krankheitsassoziierte Phänotypen direkt der jeweiligen genetischen Veränderung zugeordnet werden können, ohne durch Unterschiede im individuellen genetischen Hintergrund überlagert zu werden.
Aus diesen iPSC-Linien werden zunächst 2D-retinale Zellmodelle etabliert, um frühe, zellautonome Effekte von RP2-Varianten systematisch zu analysieren. Diese reduzierten Modellsysteme erlauben eine hohe experimentelle Kontrolle und eignen sich besonders für quantitative Assays, beispielsweise zur Untersuchung von ziliärer Organisation, Proteinlokalisation, Transportprozessen, Stressantworten, Photorezeptor-spezifischen Differenzierungsmerkmalen und frühen Degenerationssignaturen. Durch den direkten Vergleich von mutierten, korrigierten und isogenen Kontrolllinien können primäre Krankheitsmechanismen identifiziert und funktionell validiert werden. Komplementär dazu werden 3D-Retina-Organoide eingesetzt, um die RP2-assoziierte Netzhautdegeneration in einem komplexeren, gewebsähnlichen Kontext abzubilden. Retina-Organoide enthalten unterschiedliche retinale Zelltypen und ermöglichen die Untersuchung von Entwicklungs-, Reifungs- und Degenerationsprozessen über längere Zeiträume. Dadurch können zelltypspezifische Veränderungen, insbesondere in Photorezeptoren, sowie Wechselwirkungen zwischen verschiedenen retinalen Zellpopulationen analysiert werden. Mittels hochauflösender Bildgebung, Transkriptomik, Proteomik und weiteren Multi-Omics-Ansätzen sollen krankheitsrelevante Signalwege, vulnerable Zellzustände und therapeutisch adressierbare Mechanismen identifiziert werden.
Darüber hinaus dienen die iPSC-basierten 2D- und 3D-Modelle als erste präklinische Testplattform für therapeutische Ansätze. Potenzielle Wirkstoffe, Genersatzstrategien oder Genomeditierungsansätze können zunächst in robusten 2D-Assays auf Wirksamkeit, Dosisabhängigkeit und zelluläre Verträglichkeit geprüft und anschließend in Retina-Organoiden unter gewebsähnlicheren Bedingungen validiert werden. Damit verbindet die iPSC-Plattform mechanistische Krankheitsaufklärung unmittelbar mit translationaler Therapieentwicklung und ermöglicht eine rationale Priorisierung der vielversprechendsten Behandlungsstrategien für die RP2-assoziierte Retinitis Pigmentosa.
Identifizierung neuer Wirkstoffe
Identifizierung neuer Wirkstoffe
Auf Basis der entschlüsselten Signalwege und zellulären Mechanismen suchen wir systematisch und gezielt nach Substanzen, die gestörte Prozesse stabilisieren oder korrigieren können. So wollen wir Kandidaten identifizieren, die in präklinischen Modellen und perspektivisch in klinischen Studien weiter geprüft werden können.
Detail-Beschreibung
Funktionell wirkt RP2 als GTPase-aktivierendes Protein für die kleine GTPase ARL3 und ist damit indirekt an den ziliären und vesikulären Transportprozessen beteiligt, die ARL3 maßgeblich reguliert. Durch die Bindung an ARL3 bringt RP2 zusätzliche katalytische Seitenketten in das aktive Zentrum der ARL3-GTPase ein und beschleunigt so die eigentlich sehr langsame GTP-Hydrolyse um das 90.000-Fache. Durch den RP2-Verlust akkumuliert ARL3-GTP und Cargos im Zilium der Photorezeptoren werden fehlgeleitet. Mittels modernster KI-basierter Methoden werden wir auf der Basis der Kristallstruktur der RP2-ARL3-Interaktion Moleküle und Wirkstoffe designen, die das aktive Zentrum von ARL3 direkt vervollständigen und die GTP-Hydrolyse beschleunigen. Basierend auf den bekannten Strukturen von ARL3‑GTP-RP2 wollen wir Proteintaschen identifizieren, in denen ein „künstlicher Finger“‑Ligand Platz hätte und binden könnte. So ist es denkbar, dass kleine Moleküle oder Peptide spezifisch an ARL3 binden und funktionell einen Arginin‑ oder Lysinfinger imitieren, der den Übergangszustand der GTP-Hydrolyse übernehmen könnte. In Analogie zu Therapieansätzen der RAS-GTPase werden wir auch versuchen, mittels bestimmter Konformationsmodulierungen der Switch‑Regionen die intrinsische GTP‑Hydrolyse von ARL3 zu begünstigen, auch ohne RP2. Auch kann ein Inhibitor von ARL13B oder der GTP‑Bindung dazu führen, dass weniger ARL3‑GTP nachgeladen wird, so dass die vorhandene intrinsische Hydrolyse ausreicht, um den Steady‑State‑GTP‑Anteil zu senken. Diese neuen Wirkstoffe und ihren Effekt auf die ARL3-GTP-Hydrolyse Aktivität werden wir initial in unseren zellulären Modellen testen.
Darüber hinaus werden unsere Multi-Omics-Analysen an retinalen Organoiden neue Signalwege entschlüsseln, die in der Entstehung der RP2-assoziierten Netzhautdegeneration zusätzlich eine wichtige Rolle spielen. Deren genaue Bedeutung für verschiedene Netzhautzelltypen werden Gegenstand unserer Forschung sein und neue Ansatzpunkte für gezielte medikamentöse Interventionen bieten.
Gentherapie
Gentherapie
Wir etablieren Genersatzstrategien und Genomeditierungsansätze mit dem Ziel, eine klinisch anwendbare Gentherapie für die RP2‑assoziierte Retinitis Pigmentosa zu entwickeln. Das vergleichsweise kleine RP2‑Gen ist besonders gut für den Gentransfer geeignet und eröffnet damit vielversprechende therapeutische Optionen.
Detail-Beschreibung
Da die Mehrzahl der beschriebenen ursächlichen RP2-Varianten zu einem Funktionsverlust des RP2-Proteins führt, stellt die Genaddition einen besonders viel versprechenden therapeutischen Ansatz dar, auch begünstigt durch die kurze kodierende Sequenz des RP2-Gens (1053 Nukleotide). Unseres Wissens hat jedoch noch kein genbasierter Therapieansatz für RP2 die klinische Entwicklung erreicht.
Im Rahmen von InsightRP2 entwickeln wir aktuell Strategien zur lokalen RP2-Genaddition. Dabei greifen wir auf etablierte Konzepte mittels Adeno-assoziierten-Virus-Vektoren (AAV) zurück und verbessern das Vektordesign mit dem Ziel, eine effiziente und gezielte Wiederherstellung der RP2-Funktion in den betroffenen Photorezeptoren und Ganglienzellen zu ermöglichen. Da sich unter anderem die Effizienz der Transgenexpression zwischen verschiedenen Spezies erheblich unterscheiden kann, soll eine erste Bewertung der AAV-vermittelten Gentherapie, zusätzlich zu differenzierten Photorezeptoren, in Netzhautorganoiden untersucht werden, um einen physiologisch relevanten Kontext für die Beurteilung der Vektoreffizienz vor der Validierung in Tiermodellen zu gewährleisten. Weitere wichtige Themen, die wir adressieren, sind die Wirksamkeit von photorezeptorspezifischen im Vergleich zu ubiquitären Promotoren sowie die Transfektionseffizienz verschiedener Kapside in unterschiedlichen retinalen Zelltypen. Ergänzend zur Genaddition bieten in vivo verabreichte Base- und Prime-Editoren das Potenzial für eine mutationsspezifische Korrektur von bestimmten RP2-Varianten und könnten somit eine zukünftige alternative Strategie darstellen.